Σπούδασε ζωγραφική στο Σχολείο των Τεχνών (1850-1856), με δασκάλους τους αδελφούς Φίλιππο και Γεώργιο Μαργαρίτη, το μοναχό Αγαθάγγελο Τριανταφύλλου, τον Raffaello Ceccoli και τον Λουδοβίκο Θείρσιο, τον οποίο μάλιστα βοήθησε στην αγιογράφηση της Ρωσικής Εκκλησίας στην Αθήνα (1853-1855). Το 1860 και αφού δίδαξε δύο χρόνια (1856-1858) Στοιχειώδη Γραφική στο Σχολείο των Τεχνών, έφυγε για το Μόναχο, όπου, με υποτροφία της ελληνικής κυβέρνησης αρχικά και την υποστήριξη του βαρώνου Σίμωνα Σίνα στη συνέχεια, ολοκλήρωσε τις σπουδές του στην Ακαδημία Καλών Τεχνών, με βασικότερο δάσκαλο τον Karl von Piloty. Το 1865 επέστρεψε στην Αθήνα και τον επόμενο χρόνο διορίστηκε καθηγητής ζωγραφικής στο Πολυτεχνείο, παραμένοντας στη θέση αυτή μέχρι το θάνατό του. Υπήρξε στενός φίλος του Νικολάου Γύζη, με τον οποίο επισκέφθηκε τη Μικρά Ασία το 1873, το Μόναχο το 1874, παραμένοντας ως το 1875, και το Παρίσι το 1876, ενώ το 1879 ταξίδεψε στην Αίγυπτο.

Το 1855, ενώ ήταν ακόμη φοιτητής, έλαβε μέρος στην Παγκόσμια Έκθεση του Παρισιού, στην οποία συμμετείχε επίσης το 1867, το 1878, το 1889 και το 1900, κερδίζοντας στις δύο τελευταίες το χάλκινο μετάλλιο, ενώ το 1873 έλαβε μέρος στην Παγκόσμια Έκθεση της Βιέννης. Παράλληλα ανέπτυξε πλούσια δραστηριότητα και στην Ελλάδα, συμμετέχοντας το 1881 στην έκθεση της Οικίας Μελά, το 1888 στην Πανελλήνια του Ζαππείου, το 1896 στην Πανελλήνια που οργανώθηκε στο πλαίσιο των Ολυμπιακών Αγώνων, σε εκθέσεις του Παρνασσού κ.ά. Μετά το θάνατό του έργα του παρουσιάστηκαν σε διάφορες διοργανώσεις στην Ελλάδα και το εξωτερικό, όπως η έκθεση “Η σχολή του Piloty 1858-1886”, που έγινε το 1909 στη γκαλερί Heinemann στο Μόναχο και η Διεθνής Έκθεση της Ρώμης το 1911. Το 1933 εξάλλου, η Σχολή Καλών Τεχνών οργάνωσε μεγάλη αναδρομική παρουσίαση του έργου του.

Ο Νικηφόρος Λύτρας υπήρξε από τους βασικότερους εκπροσώπους της Σχολής του Μονάχου, θεωρείται δε πατέρας της νεοελληνικής ζωγραφικής. Αν και είχε γνωρίσει τον ιμπρεσιονισμό, παρέμεινε πιστός στην ακαδημαϊκή παράδοση και ασχολήθηκε με όλες σχεδόν τις θεματογραφικές περιοχές: προσωπογραφίες, νεκρές φύσεις, ιστορικές σκηνές και μυθολογικά θέματα. Το σημαντικότερο όμως μέρος του έργου του αποτέλεσαν οι ηθογραφικές παραστάσεις, τις οποίες εκείνος ουσιαστικά εισήγαγε στην ελληνική ζωγραφική και περιλαμβάνουν σκηνές από την ελληνική επαρχία και τον αστικό χώρο, την ελληνική οικογένεια και τον κόσμο του παιδιού, αλλά και θέματα από την Ανατολή. Ανανεωτής θεωρείται και στον τομέα της προσωπογραφίας, όπου είναι εμφανής η προσπάθεια ψυχολογικής διείσδυσης στην προσωπικότητα του εικονιζομένου. Εξαιρετικά σημαντική υπήρξε επίσης η διδακτική του προσφορά, επηρεάζοντας αποφασιστικά τις επόμενες γενιές με τη σαραντάχρονη σχεδόν διδασκαλία του στο Σχολείο των Τεχνών, στη διάρκεια της οποίας κατέβαλε μεγάλες προσπάθειες για την αναβάθμιση των σπουδών και την αναδιοργάνωση του καλλιτεχνικού τμήματος.