Το έργο διαδραματίζεται στη Ζάκυνθο και αποτελεί τη θεατρική διασκευή ενός μικρού θεατρικού διηγήματος, με τον ομώνυμο τίτλο. Στην άλλοτε αρχοντική οικογένεια των Βαλέρηδων, μόνο η γριά Βαλέραινα γνωρίζει τη συνταγή που γιατρεύει μια αρρώστια των ματιών. Έχει ορκιστεί ότι θα την κρατήσει μυστική και θα παρέχει το φάρμακο αφιλοκερδώς σε όποιον το έχει ανάγκη. Μόνο από Βαλέραινα σε Βαλέραινα μπορεί να κληρονομηθεί το γιατρικό, η παράδοση του οποίου κρατάει πάνω από διακόσια πενήντα χρόνια και για να τεθεί σε ισχύ θα πρέπει να δοθεί πριν πεθάνει η Βαλέραινα.

Η φτώχεια όμως έρχεται να κλονίσει την οικογένεια και να δοκιμάσει τη στάση των ηρώων απέναντι στο χρήμα και τις ηθικές αξίες. Η Βαλέραινα δέχεται σωρεία δελεαστικών προτάσεων για την πώληση του μυστικού. Μία εσωτερική πάλη μεταξύ ανάγκης και ηθικού χρέους ξεκινάει, με το γιατρικό να αποτελεί την αιτία σύγκρουσης των ηρώων και τον Ξενόπουλο να δίνει μία μεγαλοφυή λύση.

Η στάση των ηρώων απέναντι στα ηθικά ιδεώδη αποτελεί τον κεντρικό άξονα του ζακυνθινού, γεμάτου σασπένς και με ανατροπές, αστικού δράματος. Στις δύσκολες στιγμές, η αξία της τιμής και της αξιοπρέπειας έρχεται αντιμέτωπη με την ανάγκη και το χρήμα. H απόφαση της Κοντέσσας Βαλέραινας είναι καθοριστική για το μέλλον της οικογένειας των Βαλέρηδων. Το ζήτημα που θίγει ο Ξενόπουλος στο έργο του παραμένει επίκαιρο, με την αρετή της αξιοπρέπειας  από τη μία πλευρά και τη διαφθορά του χρήματος από την άλλη να βρίσκονται στο επίκεντρο του έργου.

Ο ίδιος ο συγγραφέας έχει χαρακτηρίσει «Το Μυστικό της Κοντέσσας Βαλέραινας» ως «το καλύτερο έργο της ζωής του». Σπουδαίες ηθοποιοί του ελληνικού θεάτρου, όπως η Ευαγγελία Παρασκευοπούλου, η Μαρίκα Κοτοπούλη, η Κυβέλη και η Άννα Συνοδινού έχουν ερμηνεύσει τον πρωταγωνιστικό ρόλο και το έργο έχει σημειώσει τεράστια επιτυχία.  

«…Το Μυστικό της Κοντέσσας Βαλέραινας το συνέλαβα νέος, το έγραψα άντρας, το ξανάγραψα μεσόκοπος, το τελείωσα σχεδόν γέρος. Είναι το έργο όλης μου της ζωής.

Ό,τι μ’ αρέσει προπάντων σ’ αυτό, είναι η ευγένεια κι η πρωτοτυπία του μύθου, -ποτέ μου δεν ξαναβρήκα θέμα παρόμοιο ούτε στη Φιλολογία μας υπάρχει, ούτε στο ξένο Θέατρο θα μπορούσε κανείς να βρει εύκολα κάτι που να του μοιάζη- κι η αυστηρότης, η συμμετρία της δραματικής μορφής. Είναι κάτι βαθιά Ζακυνθινό, μα συγχρόνως και βαθιά Ελληνικό. Και μπόρεσα να το σφικτοδέσω, να το βάλω όλο σε μιά μεγάλη πράξη, χωρισμένη απλά και φυσικά σε τρία μικρά μέρη, γιατί το δράμα αρχίζει το πρωΐ, στον ίδιο πάντα τόπο, τελειώνει το βράδυ. Εκείνο που λέμε «σκηνική οικονομία» σε κανένα μου έργο δε φαίνεται τελειότερο· και μπορεί κανείς να προσέξη μόνο στα μπαινοβγάλματα των προσώπων στη σκηνή που είναι ο σκόπελος όχι μόνο των αρχαρίων…

Έπειτα δεν έχει ούτε μια λέξη παραπάνω, που να μη χρειάζεται δηλαδή απολύτως στην εξέλιξη του μύθου, στην πρόοδο του δράματος και συγχρόνως στο χαρακτηρισμό των προσώπων. Όλ’ αυτά χωρίς περιττό στολίδι, χωρίς θεατρικό κόλπο κανένα. «Με τα λιτότερα δραματικά μέσα», παρατηρεί ένας κριτικός…»

Γρηγόριος Ξενόπουλος, Από τον Πρόλογον του 1918